- قبل از شروع کار از سالم بودن هود اطمینان حاصل کنید.
- هود مورد استفاده در اتاق کشت هود لامینار کلاس II میباشد که دارای فیلترهای HEPA هستند.
- زیر هود و سطوح تمام وسایلی که باید زیر هود آورده شود، از قبل با الکل ۷۰% ضدعفونی میشوند.
- وسایل زیر هود به ترتیب از چپ به راست از وسایل استریل به سمت waste چیده می شوند.
- بهتر است قبل از شروع به کار چک لیستی از کارهایی که باید انجام بدهید(ضدعونی کردن سطوح، استریل کردن وسایل، اطمینان از تمیزی روپوش، روشن کردن لامپ UV و ....) تهیه کنیم تا از انجام آنها اطمینان داشته باشیم.
- پاساژ دادن یا تهیه subculture به معنی انتقال سلول های در حال تکثیر به فلاسک حاوی محیط جدید است.
- میزان سلول و حجم مناسب با توجه به فلاسک و پلیت های مختلف در جدول زیر به نمایش در امده است:
۸. کلمه Confluence به معنی درصد پرشدن فضای فلاسک یا پلیت کشت است وقتی Confluence به ۷۰ الی ۸۰% رسید سلولها باید پاساژ داده شوند.
۹.زمان مناسب برای پاساژ دادن سلول ها هنگامی است که سلول ها در مرحله log نمودار رشد خود باشند؛ به عبارت دیگر قبل از ایجاد clump وکدورت محیط.
۱۰. آلودگی باکتریایی به راحتی با چشم غیر مسلح نیز قابل تشخیص هستند: محیط کشت ظاهر ابری (cloudy) به خود میگیرند. و pH محیط نیز به طور ناگهانی کاهش پیدا میکند(زرد رنگ).
نکات مهم جهت جداسازی سلولهای تک هسته ای با فایکول:
۱- محلول های PBS، فایکول و تمام لوله ها قبل از انجام کار در دمای محیط قرار میگیرند.
۲- جداسازی سلولهای تک هسته ای باید در کمتر از ۸ ساعت بعد از خونگیری انجام شود، بهترین نتیجه دو ساعت بعد از خونگیری بدست میاید.
تعداد سلول های مورد انتظار از هر سی سی خون محیطی در جدول زیر به نمایش در امده است.
۴- میزان زمان مواجه سلول ها با فایکول باید به حداقل زمان ممکن برسد(سرعت عمل بالا)
۵- خون حاوی ماده ضد انعقاد با PBS یا RPMI به نسبت ۱:۱ رقیق میشود.
۶- میزان حجم فایکول مورد استفاده به طور معمول برابر با حجم خون اولیه (خون رقیق نشده) است.
به طور معمول: ۴ سی سی فایکول برای ۳ تا ۵ سی سی خون رقیق نشده در یک لوله فالکون ۱۵
۲۰ سی سی فایکول برای ۱۵ تا ۱۸ سی سی خون رقیق نشده در یک لوله فالکون ۵۰
۷- خون رقیق شده باید به آرامی به فایکول اضافه شود تا لایه اول شکل بگیرد.
۸- سانتریفوژ در دمای ۲۵ درجه و دور g۴۰۰ به مدت ۳۰ دقیقه ( شتاب:۲ ترمز :۰)
*تجربه شخصی : rpm ۲۸۰۰ به مدت ۲۵ دقیقه*
۹- بعداز جداکردن سلول های تک هسته ای (buffy coat) سلول ها دو بار شستشو داده شوند(g۵۰۰ به مدت ۸ دقیقه)
۱۰- برای حذف پلاکت سلول ها با دورg ۲۰۰ به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ میشوند.
تهیه و تدوین :
مریم عظیمی
دکتری تخصصی ایمونولوژی