انجمن ایمونولوژی و آلرژی ایران- ایمونولوژی تشخیصی و تحقیقاتی
به منظور تعیین فراوانی انواع سلولهای ایمنی مترشحه مانند زیر مجموعه های سلولهای T، سلولهای B وسلولهای ایمنی ذاتی � آزمون(Enzyme linked immunospot) ELISPOT

حذف تصاویر و رنگ‌ها  | تاریخ ارسال: ۱۳۹۸/۱/۳۱ | 
آزمون(Enzyme linked immunospot)  ELISPOT ، به منظور  تعیین فراوانی انواع سلولهای ایمنی مترشحه  مانند زیر مجموعه های سلولهای T، سلولهای B وسلولهای ایمنی ذاتی به کار می رود.   اساس این تست مشابه الایزا است ولی در مقایسه با تکنیک الایزا ، اجرای ازمون ELISPOT اسانتر بوده و دارای حساسیت بالاتری است (20 تا 200 بار بیشتر از روش الایزا) این ازمون  توانایی شناسایی 1 سلول در 100,000 سلول را داراست . در ازمون ELISPOT  توانایی سلول ترشح کننده  با شمارش  نقاط ایجاد شده در کف چاهک ها بررسی می شود می سازد. واحد اندازه گیری تکنیک   (Spot forming cells)  SFC  است که  سنجش کمی و ارزیابی فعالیت ترشحی سلولی  را امکان پذیر می سازد.

سایر مطالب این بخش


در مقایسه با روش‌هایی که بر اساس سنجش آنالیت در سرم هستند مانند الایزا، این تکنیک دارای حساسیت بالاتری است، زیرا مواد ترشحی پس از آزاد شدن از سلول‌ها، سلول‌ها را فرا گرفته و قبل از رقیق شدن در محیط و یا قبل از تأثیر پروتئازها بر آنها و یا اتصال به رسپتور‌های محلول و حذف شدن، به آنتی‌بادی پوشاننده متصل می‌شوند.
 
 
 
مراحل انجام ELISPOT  به صورت شماتیک در تصویر شماره 1 به نمایش درآمده است:

تصویر 1: مراحل آزمون Elispot
 
آنالیز نتایج آزمونELISPOT
شمارش نقاط در آزمون ELISPOT: پس از اتمام آزمون، نقاط می‌توانند به دو روش دستی یا کامپیوتری که از نقاط تصویربرداری می‌کنند، شمارش شوند. شمارش دستی به وسیله میکروسکوپ انجام می‌شود و مشکل و زمانبر است ولی به نظر می‌رسد دارای حساسیت بالاتری نسبت به روش کامپیوتری است و به محقق این امکان را می‌دهد تا بتواند نقطه‌های کمرنگ و بسیار کوچک را از نظر واقعی یا غیرواقعی بودن بررسی نماید. البته خطاهایی نیز ممکن است در روش شمارش دستی ایجاد شود، به عنوان مثال ممکن است نقاط بسیار کوچک مورد شمارش قرار نگیرند، در حالیکه دو نقطه نزدیک به هم ممکن است به عنوان یک نقطه شمارش شود.



تصویر2: تصویر چاهک آزمون ELISPOT سلول‌های ترشح کننده  سایتوکاین (سمت راست).  عدم حضور  سلول ترشح کننده‌ سایتوکاین ( سمت چپ)
 
کاربرد بالینی آزمون ELISPOT
در زمینه کارآزمایی‌های بالینی، آزمون ELISPOT استفاده زیادی در موارد زیر دارد:
  • طراحی واکسن
  •  تعیین نقشه اپی‌توپیک سلول‌هایT
  • تحقیقات در زمینه بیماری ایدز
  • مطالعه سرطان
  •  مطالعه عوامل عفونی
  • مطالعه آلرژی
  • مطالعه پیوند
  • مطالعه بیماری‌های اتوایمیون
  • بررسی اپوپتوز


برخی از کاربردهای ELISPOT
آزمون ELISPOT یکی از روشهای حساس و خاص برای تشخیص پاسخT های ایمونولوژیک لنفوسیت های T  و B می باشد.  از جمله مزایای این تست میتوان  به سرعت انجام بالا، سادگی روش ، حساسیت بالا (سطح تشخیص یک سلول از یک میلیون)، پتانسیل آن برای غربالگری بالا وارزانی آن اشاره کرد.  در ادامه به برخی از موارد کاربرد این تکنیک اشاره میشود.
  1. خودایمنی :
 حساسیت بالا در آزمایش ELISPOT به ویژه در مطالعات خودایمنی مفید است، زیرا پاسخ های سلولی T و B به طور معمول از پاسخ ایمنی مرتبط با ویروس و واکسن ، بسیار کمتر است. به عنوان مثال در تشخیص دیابت نوع 1؛  بیماری دیابت نوع 1 یک نوع اختلال خودایمنی مزمن میباشد و  منجر به تخریب سلول های بتا تولید انسولین خواهد شد، سلول های T نقش کلیدی ایفا می کنند، اما شناسایی این لنفوسیت ها  بسیار دشوار است. اما خوشبختانه با کمک آزمون ELISPOT، ترشح سایتوکاین  توسط سلول های  T خود واکنشگر که با آنتی ژن های خودی فعال شدند را میتوان اندازه گیری کرد.  
شکل زیر نتیجه آزمون ELISPOT را در یک بیمار مبتلا به دیابت (پایین) در مقایسه با فرد نرمال نشان میدهد:
 
 

 
2. سرطان:
3. بیماری های عفونی
تکامل و گسترش سرطان دهانه رحم و کارسینوم سلول های کبدی به شدت با ویروس پاپیلومای انسانی (HPV) و ویروس هپاتیت B (HBV) ارتباط دارد. محققان در تلاش هستند با شناسایی آنتی ژن های خاص و انتخابی  (که اغلب منشاء ویروسی دارند) واکسن های اختصاصی سرطن  را تولید کنند و  درنهایت موفق به ریشه کن کردن این نوع خاص از سرطانها شوند. برای این کار، محققان باید روی کینتیک ایمنی واکسن T-cell متمرکز شوند  و توانایی آنتی ژن ها را برای القای پاسخهای اختصاصی لنفوسیت های  T را بررسی کنند.  برای این منظور، آزمایش ELISPOT یک ابزار ایده آل برای شناسایی لنفوسیت های T CD8+ فعال شده با آنی ژن های توموری است. در این روش میتوان میزان توانایی آنتی ژن توموری مورد نظر در القای پاسخ سایتوکاینی را با سایر پپتید ها مقایسه کرد.
همچنین با کمکاندازه گیری تعداد نقاط ایجاد شده در ELISPOT فرکانس سلول T CD8+ پاسخ دهنده  و  ایمنی­زایی آنتی ژن توموری را به عنوان واکسن  ارزیابی میشود.
 
شکل زیر کارایی ELISPOT  را در اندازه گیری پاسخ های اختصاصی ضدتومور نشان میدهد:
 
 
آزمایش ELISPOT می تواند در مطالعه بیماری های عفونی مانند ایدز، هپاتیت، آبله و  سل مفید باشد. اغلب اندازه گیری های قابل اعتماد از واکنش های ایمنی به عفونت های باکتریایی، انگلی یا ویروسی ضروری است ، به عنوان مثال در تشخیص بیماری سل فعال می‌توان از این آزمون استفاده کرد که در مرحله کارآزمایی بالینی مثمر ثمر بوده است. در تشخیص این بیماری سنجشELISPOT حساس‌تر و اختصاصی‌تر از آزمون رایج PPD است که در شناسایی بیماری سل نهفته کاربرد دارد. علاوه براین، با کمک آزمون  ELISPOT میتوان پاسخ های اختصاصی ضد پاتوژن ها در طول یک مدت زمان معلوم، اندازه گیری کرد، و از این طریق تولید پاسخ های خاطره ای را دریافت کنندگان واکسن میتوان اندازه گیری کرد.
 
یکی از مزایای آزمایش ELISPOT این است که تنها سلول های اختصاصی آنتی ژن را شناسایی می کند و بنابراین  فراوانی سلولهای T  اجرایی را مستقیما اندازه گیری خواهد کرد.  بسیاری از محققان، با این روش به واسطه ماهیت سایتوکاین  های اختصاصی متفاوت و متقابل منحصر به فرد شناخته شود میتوانند تعادل بین پاسخ های انواع زیررده های سلول T CD4 + (یعنی Th1 و Th2) را بررسی می کنند، به عنوان مثال، محققان با استفاده از ازمون های همزمان  ELISPOT پاسخ های اختصاصی Th1 (IFN-γ و IL-2) و Th2 (IL-4 و IL-13) را در  افراد غیر واکسینه شده و غیر واکسینه اندازه گیری کنند.  
 
شکل زیر مراحل آزمون  ELISPOT  در اندازه گیری پاسخ اختصاصی سلول های T علیه ویروس CMV را نشان میدهد:


 
 
 
 
 

 
  1. پیوند
در زمینه پیوند عضو، آزمایش های قابل اعتماد in vitro برای پیش بینی نتیجه و به عنوان راهنمای برای مداخلات درمانی پس از پیوند نیاز  هست. آزمایش ELISPOT ، می تواند بطور دقیق فراوانی و پروفایل سایتوکاین  های تولیدی از لنفوسیت های T واکنش پذیر را اندازه گیری کند. مطالعات مختلف نشان داده اند که تعداد سلول های T تولید کننده IFN-γ با نتایج پس از پیوند مرتبط است. افزایش تعداد سلول های تولید کننده IFN-γ اختصاصی قبل از پیوند با خطر رد حاد و اختلال در عملکرد پس از انتقال رابطه مستقیم دارد. . علاوه بر این، این آزمون در نظارت بر ایمنی alloreactivity پس از کاهش یا از بین بردن سوسک های ایمنی بدن سمی و شناسایی بیماران متحمل به آلوگرافت آنها ارزش زیادی دارد. نظارت ELISPOT امکان پذیر است. بنابراین، پزشکان ممکن است از آزمون ELISPOT همراه با آزمایش های اضافی به عنوان یک روش معمول برای بهینه سازی درمان با سرکوب ایمنی با حداقل عوارض جانبی برای پیوند طولانی مدت و بقای بیمار استفاده کنند. بنابراین، در اینده ای نه چندان دور، پزشکان ممکن است از آزمون ELISPOT در کنار  آزمایشات روتین به عنوان یک روش معمول برای بهینه سازی پیوند حداقل عوارض جانبی برای پیوند طولانی مدت و بقای بیمار استفاده کنند.

تهیه و تدوین :
 مریم عظیمی
دکتری تخصصی ایمونولوژی
 
منابع جهت مطالعه بیشتر:
Achkar JM, Lawn SD, Moosa M-YS, Wright CA, Kasprowicz VO. Adjunctive tests for diagnosis of tuberculosis: serology, ELISPOT for site-specific lymphocytes, urinary lipoarabinomannan, string test, and fine needle aspiration. Journal of Infectious Diseases. 2011;204(suppl 4):S1130-S41.
Arvilommi H. ELISPOT for detecting antibody‐secreting cells in response to infections and vaccination. Apmis. 1996;104(1‐6):401-10.
Carvalho LH, Hafalla JC, Zavala F. ELISPOT assay to measure antigen-specific murine CD8+ T cell responses. Journal of

 
نشانی مطلب در وبگاه انجمن ایمونولوژی و آلرژی ایران:
http://isiaonline.org/find.php?item=1.220.83.fa
برگشت به اصل مطلب